Introducción
En su afán
de llegar siempre lejos en la investigación de la naturaleza más allá de lo que
los límites de nuestros órganos sensoriales le imponen, el hombre ha construido
múltiples instrumentos que le han permitido acceder allí donde los sentidos no
podían penetrar.
Así como el
telescopio abrió a la humanidad las puertas de lo infinitamente grande, el
microscopio hizo posible conocer los mundos de dimensiones ínfimas, entre ellos
la célula, base de la vida. Se contaban así las bases de las modernas ciencias
biológicas que hasta entrada la edad moderna se habían fundado en las
observaciones directas.
Los microscopios son aparatos
que, en virtud de las leyes de formación de imágenes ópticas aumentadas a
través de lentes convergentes, permiten la observación de pequeños detalles de
una muestra dada que a simple vista no se percibirían.
MICROSCOPÍA
I.
Fundamento
Historia
- 1608 Zacharias Jansen construye un microscopio con
dos lentes convergentes.
- 1611 Kepler sugiere
la manera de fabricar un microscopio compuesto.
- 1665 Robert
Hooke utiliza un microscopio compuesto para estudiar cortes de corcho y
describe los pequeños poros en forma de caja a los que él llamó "células".
Publica su libro Micrographia.
- 1674
Leeuwenhoek informa su descubrimiento de protozoarios. Observará bacterias
por primera vez 9 años después.
- 1828 W.
Nicol desarrolla la microscopía con luz
polarizada.
- 1838
Schleiden y Schwann proponen la teoría de la célula y
declaran que la célula nucleada es la unidad estructural y funcional en
plantas y animales.
- 1849 J.
Quekett publica un tratado práctico sobre el uso del microscopio.
- 1876
Abbé analiza los efectos de la difracción
en la formación de la imagen en el microscopio y muestra cómo perfeccionar
el diseño del microscopio.
- 1881
Retzius describe gran número de tejidos animales con un detalle que no ha
sido superado por ningún otro microscopista de luz. En las
siguientes dos décadas él, Cajal y otros histólogos
desarrollan nuevos métodos de tinción y ponen los fundamentos de la
anatomía microscópica.
- 1886 Carl
Zeiss fabrica una serie de lentes, diseño de Abbé que permiten al
microscopista resolver estructuras en los límites teóricos de la luz
visible.
- 1908
Köhler y Siedentopf desarrollan el microscopio de fluorescencia.
- 1930
Lebedeff diseña y construye el primer microscopio de
interferencia.
- 1932
Zernike inventa el microscopio de contraste de fases.
- 1937 Ernst
Ruska y Max Knoll, físicos alemanes, construyen el primer microscopio electrónico.
- 1952
Nomarski inventa y patenta el sistema de contraste de interferencia
diferencial para el microscopio de luz.
Microscopio compuesto
Es un microscopio óptico que tiene más de una lente de objetivo.
Los microscopios compuestos se utilizan especialmente para examinar objetos transparentes,
o cortados en láminas tan finas que se transparentan. Se emplea para aumentar o
ampliar las imágenes de objetos y organismos no visibles a simple vista. El
microscopio óptico común está conformado por tres sistemas:
- El
sistema mecánico está constituido por una palanca que sirve para sostener,
elevar y detener los instrumentos a observar.
- El
sistema de iluminación comprende un conjunto de instrumentos, dispuestas
de tal manera que producen las ranuras de luz.
El
sistema óptico comprende las partes del microscopio que permiten un aumento de
los objetos que se pretenden observar mediante filtros llamados "de
aceites de inmersión".
Trayectoria del rayo de luz a través
del microscopio
El haz luminoso procedente de la lámpara pasa
directamente a través del diafragma al condensador. Gracias al sistema de
lentes que posee el condensador, la luz es concentrada sobre la preparación a
observar. El haz de luz penetra en el objetivo y sigue por el tubo hasta llegar
al ocular, donde es captado por el ojo del observador.
Propiedades del microscopio
- Poder
separador. También llamado a veces poder de resolución, es una cualidad
del microscopio, y se define como la distancia mínima entre dos puntos
próximos que pueden verse separados. El ojo normal no puede ver separados
dos puntos cuando su distancia es menor a una décima de milímetro. En el
microscopio viene limitado por la longitud de onda de la radiación
empleada; en el microscopio óptico, el poder separador máximo conseguido
es de 0,2 décimas de micrómetro (la mitad de la longitud de onda de la luz
azul), y en el microscopio electrónico, el poder separador llega hasta 10 Å.
- Poder de
definición. Se refiere a la nitidez de las imágenes obtenidas, sobre todo
respecto a sus contornos. Esta propiedad depende de la calidad y de la
corrección de las aberraciones de las lentes utilizadas.
- Ampliación
del microscopio. En términos generales se define como la relación entre el
diámetro aparente de la imagen y el diámetro o longitud del objeto. Esto
quiere decir que si el microscopio aumenta 100 diámetros un objeto, la
imagen que estamos viendo es 100 veces mayor linealmente que el tamaño
real del objeto (la superficie de la imagen será 1002, es decir
10.000 veces mayor). Para calcular el aumento que está proporcionando un
microscopio, basta multiplicar los aumentos respectivos debidos al
objetivo y el ocular empleados. Por ejemplo, si estamos utilizando un
objetivo de 45X y un ocular de 10X, la ampliación con que estamos viendo
la muestra será: 45X x 10X = 450X, lo cual quiere decir que la imagen del
objeto está ampliada 450 veces, también expresado como 450 diámetros.
Campo del
microscopio
Paramecium aurelia. Microscopio
óptico. El mejor conocido de los ciliados. Las burbujas que se ven son vacuolas. Todo el
cuerpo está cubierto de cilios, que se ven borrosos debido a sus rápidos
movimientos.
Se
denomina campo del microscopio al círculo visible que se observa a través del
microscopio. También podemos definirlo como la porción del plano visible observado
a través del microscopio. Si el aumento es mayor, el campo disminuye, lo cual
quiere decir que el campo es inversamente proporcional al aumento del
microscopio. Para medir el diámetro del campo del microscopio con cualquiera de
los objetivos se utiliza el micrómetro, al que se hará referencia en el
siguiente punto
Tipos de microscopios
Existen diversas clases de microscopios,
según la naturaleza de los sistemas de luz, y otros accesorios utilizados para
obtener las imágenes.
El microscopio compuesto u óptico
utiliza lentes para ampliar las imágenes de los objetos observados. El aumento
obtenido con estos microscopios es reducido, debido a la longitud de onda de la
luz visible que impone limitaciones. El microscopio óptico puede ser monocular,
y consta de un solo tubo. La observación en estos casos se hace con un solo
ojo. Es binocular cuando posee dos tubos. La observación se hace con los dos
ojos. Esto presenta ventajas tales como mejor percepción de la imagen, más
cómoda la observación y se perciben con mayor nitidez los detalles.
Microscopio estereoscópico: el
microscopio estereoscópico hace posible la visión tridimensional de los
objetos. Consta de dos tubos oculares y dos objetivos pares para cada aumento.
Este microscopio ofrece ventajas para observaciones que requieren pequeños
aumentos. El óptimo de visión estereoscópica se encuentra entre 2 y 40X o
aumento total del microscopio.
Microscopio de campo oscuro. Este
microscopio está provisto de un condensador paraboloide, que hace que los rayos
luminosos no penetren directamente en el objetivo, sino que iluminan
oblicuamente la preparación. Los objetos aparecen como puntos luminosos sobre
un fondo oscuro.
Microscopio de fluorescencia. La
fluorescencia es la propiedad que tienen algunas sustancias de emitir luz
propia cuando inciden sobre ellas radiaciones energéticas. El tratamiento del
material biológico con flurocromos facilita la observación al microscopio.
Microscopio de contraste de fases. Se
basa en las modificaciones de la trayectoria de los rayos de luz, los cuales
producen contrastes notables en la preparación.
Invención del microscopio electrónico
En 1932, Bruche y Johnsson construyen el
primer microscopio electrónico a base de lentes electrostáticas. Ese mismo año Knoll
y Ruska dan a conocer los primeros resultados obtenidos con un microscopio
electrónico Siemens, construido con lentes magnéticas. Así nace el microscopio
electrónico. Para 1936 ya se ha perfeccionado y se fabrican microscopios
electrónicos que superan en resolución al microscopio óptico.
Estos logros no sólo representan un avance en
el campo de la electrónica, sino también en el campo de la Biología, pues son muchas
las estructuras biológicas que se han descubierto y que revelan detalles
inusitados, al observarlas al microscopio electrónico.
Funcionamiento del microscopio
electrónico
El microscopio electrónico utiliza un flujo
de electrones en lugar de luz. Consta fundamentalmente de un tubo de rayos
catódicos, en el cual debe mantenerse el vacio. El cátodo está constituido por
un filamento de tungsteno, que al calentarse eléctricamente emite los
electrones, los cuales son atraídos hacia el ánodo por una diferencia de
potencial de 50.000 a
100.000 voltios. La lente del condensador enfoca este haz y lo dirige hacia el
objeto que se observa, cuya preparación exige técnicas especiales. Los
electrones chocan contra la preparación, sobre la cual se desvían de manera
desigual.
Se acostumbra a utilizar el término
microfotografías para las fotografías tomadas a través del microscopio óptico y
micrografía o electromicrografía para las que se toman en el microscopio
electrónico.
Los aumentos máximos conseguidos en el
microscopio electrónico son del orden de 2.000.000X mediante el acoplamiento al
microscopio electrónico de un amplificador de imagen y una cámara de
televisión. En resumen, el microscopio electrónico consta esencialmente de:
- Un
filamento de tungsteno (cátodo)
que emite electrones.
- Condensador
o lente
electromagnética, que concentra el haz de electrones.
- Objetivo
o lente electromagnética, que amplía el cono de proyección del haz de luz.
- Ocular o
lente electromagnética, que aumenta la imagen.
- Proyector
o lente proyectora, que amplía la imagen.
- Pantalla
fluorescente, que recoge la imagen para hacerla visible al ojo humano.
Tipos de microscopios electrónicos
Existen varios tipos de microscopios
electrónicos, que cada día se perfeccionan más. El microscopio electrónico de
transmisión que utiliza un haz de electrones acelerados por un alto voltaje
(cien mil voltios). Este haz ilumina una sección muy fina de la muestra, sean
tejidos, células u otro material.
El microscopio electrónico de barrido se
utiliza para el estudio de la morfología y la topografía de los elementos.
Estos instrumentos utilizan voltajes cercanos a los 20.000 voltios. Las lentes
magnéticas utilizan un haz muy fino de electrones para penetrar repetidamente
la muestra, y se produce una imagen ampliada de la superficie observada en la
pantalla de un monitor. El microscopio electrónico mixto tiene propiedades
comunes con el de transmisión y con el de barrido y resulta muy útil para
ciertas investigaciones. Hay otros microscopios analíticos que detectan señales
características de los elementos que constituyen la muestra.
Con estos poderosos instrumentos, que
utilizan el flujo de electrones y las radiaciones electromagnéticas así como la
aplicación de técnicas histoquímicas y bioquímicas, además del empleo de
marcadores radiactivos, se han logrado grandes avances en la biología celular.
Medición a través del microscopio
Muchas veces interesa al observador conocer
el tamaño real de los objetos o microorganismos que está observando a través
del microscopio. Para estas mediciones pueden utilizarse varios métodos. Método
de los micrómetros. Se utiliza para esto un micrómetro de platina o de objetivo,
que consiste en un portaobjetos en cuyo centro se halla una escala graduada (de
2 mm. de
longitud), con separaciones, entre cada división, de una centésima de
milímetro.
Además se utiliza un micrómetro ocular que
lleva una escala graduada en décimas de milímetros. Se coloca el micrómetro
objetivo sobre la platina y se enfoca el microscopio hasta que las líneas de la
escala graduada aparezcan nítidas. Luego se hace superponer la escala del
ocular y se toma como referencia las primeras divisiones en que una línea del
micrómetro objetivo y una línea del micrómetro ocular coincidan o se
superpongan exactamente.
Luego, por simple regla de tres, se calcula
el valor en mieras de cada división ocular. Veamos un ejemplo. Si 9 divisiones
del micrómetro objetivo (0,09mm) equivalen a 30 divisiones del micrómetro
ocular, cada división del ocular equivaldrá a: 0,09/30 = 0,003 mm. = 3 µm
Quiere decir que para el objetivo calibrado y
el ocular utilizado, cada división del micrómetro ocular equivale a 3 µm. Una
vez obtenido este dato para cada objetivo en la forma que hemos expuesto,
teniendo el microscopio ocular podrían hacerse todas las mediciones que se
deseen. Para medir, por ejemplo, un Paramecium de una preparación, procedemos
así: haremos coincidir los extremos del microorganismo con las divisiones del
micrómetro ocular. Si la longitud del organismo es de 75 divisiones del
micrómetro ocular, y cada división equivale a 3 µm, la longitud del Paramecium
será 75x3= 225 µm. También se pueden efectuar mediciones en el microscopio con
cámara clara y utilizando una regla. En realidad, estas medidas no son tan
exactas como cuando se utilizan micrómetros por errores que se introducen
superponiendo imágenes.
Mantenimiento del microscopio
El microscopio debe estar protegido del
polvo, humedad y otros agentes que pudieran dañarlo. Mientras no esté en uso
debe guardarse en un estuche o gabinete, o bien cubrirlo con una bolsa plástica
o campana de vidrio.
Las partes mecánicas deben limpiarse con un
paño suave; en algunos casos, éste se puede humedecer con xilol para disolver
ciertas manchas de grasa, aceite de cedro, parafina, etc. Que hayan caído sobre
las citadas partes.
La limpieza de las partes ópticas requiere
precauciones especiales. Para ello debe emplearse papel de óptico que expiden
las casas distribuidoras de material de laboratorio ó fotografía o utilizar un
paño de algodón. Para el polvillo se puede utilizar un perilla con pincel de
pelo de camello. Nunca deben tocarse las lentes del ocular, objetivo y
condensador con los dedos; las huellas digitales perjudican la visibilidad, y
cuando se secan resulta trabajoso eliminarlas.
Para una buena limpieza de las lentes puede
humedecerse el papel de óptica, envolviendo un palillo con algo de punta con
una solución de éter/alcohol (70-30 %) y luego pasarlo por la superficie
cuantas veces sea necesario. La limpieza de la óptica ha de realizarse en
espiral, desde el centro hacia el exterior. El aceite de cedro que queda sobre la
lente frontal del objetivo de inmersión debe quitarse inmediatamente después de
finalizada la observación. Para ello se puede pasar el papel de óptica
impregnado con una gota de xilol. En caso de estar seco debe ponerse la zona a
remojo con la solución señalada. Para guardarlo se acostumbra colocar el
objetivo de menor aumento sobre la platina y bajado hasta el tope; el
condensador debe estar en su posición más baja, para evitar que tropiece con
alguno de los objetivos. Guárdese en lugares secos, para evitar que la humedad
favorezca la formación de hongos. Ciertos ácidos y otras sustancias químicas
que producen emanaciones fuertes, deben mantenerse alejados del microscopio.
Propiedades del Microscopio
·
Poder separador. También llamado a veces poder
de resolución, es una cualidad del microscopio, y se define como la distancia
mínima entre dos puntos próximos que pueden verse separados. El ojo normal no
puede ver separados dos puntos cuando su distancia es menor a una décima de
milímetro.
En el microscopio
óptico, el poder separador máximo conseguido es de 0,2 décimas de micra, y en
el microscopio electrónico, el poder separador llega hasta 10 ángstrom.
·
Poder de definición. Se refiere a la nitidez
de las imágenes obtenidas, sobre todo respecto a sus contornos. Esta propiedad
depende de la calidad y de la corrección de las aberraciones de las lentes
utilizadas.
Aumento
del microscopio. En términos generales se define como la relación entre el
diámetro aparente de la imagen y el
diámetro o longitud del objeto, esto quiere decir que si el microscopio aumenta
100 diámetros un objeto, la imagen que estamos viendo es 100 veces mayor que el
tamaño real del objeto. Para calcular el aumento de un microscopio, basta
multiplicar el aumento del ocular por el aumento del objetivo. Por ejemplo, si
estamos utilizando un ocular de 10X y un objetivo de 45X, el aumento a que
estamos viendo la preparación será: 1OX x 45X = 450X, lo cual quiere decir que
la imagen del objeto está ampliada 450 veces.
II.
OBJETIVOS
·
Reconocer las partes del microscopio óptico.
·
Conocer su utilización para la observación de
distintas muestras biológicas.
III.
MATERIALES Y
METODOS
·
Colorantes
·
Aceite de inmersión
·
Microscopio compuesto
IV.
PROCEDIMIENTO
Se reconocerán las partes de un
microscopio óptico.
La parte mecánica
del microscopio comprende: el pie, el tubo, el revólver, el asa, la platina, el
carro, el tornillo macrométrico y el tornillo micrométrico. Estos elementos
sostienen la parte óptica
y de iluminación, además permite los desplazamientos necesarios para el enfoque
del objeto.
·
El pie. Constituye
la base sobre la que se apoya el microscopio y tiene por lo general forma de Y
o bien es rectangular
·
El tubo. Tiene forma
cilíndrica y está ennegrecido internamente para evitar las molestias que
ocasionan los reflejos de la luz. En su extremidad superior se colocan los
oculares.
·
El revólver. Es una
pieza giratoria provista de orificios en los cuales se enroscan los objetivos.
Al girar el revólver, los objetivos pasan por el eje del tubo y se colocan en
posición de trabajo,
la cual se nota por el ruido
de un piñón que lo fija.
·
La columna, llamada
también asa o brazo, es una pieza colocada en la parte posterior del aparato.
Sostiene el tubo en su porción superior y por el extremo inferior se adapta al
pie.
·
La platina. Es una
pieza metálica plana en la que se coloca la preparación u objeto que se va a
observar. Presenta un orificio en el eje óptico del tubo que permite el paso de
los rayos luminosos a la preparación. La platina puede ser fija, en cuyo caso
permanece inmóvil; en otros casos puede ser giratoria, es decir, mediante
tornillos laterales puede centrarse o producir movimientos circulares.
·
Carro. Es un
dispositivo colocado sobre la platina que permite deslizar la preparación con
movimiento ortogonal de adelante hacia atrás y de derecha a izquierda.
·
El tornillo
macrométrico.
Girando este tornillo, asciende o desciende el tubo del microscopio,
deslizándose en sentido vertical gracias a una cremallera. Estos movimientos
largos permiten el enfoque rápido de la preparación.
·
El tornillo
micrométrico.
Mediante el movimiento casi imperceptible que produce al deslizar el tubo o la
platina, se logra el enfoque exacto y nitido de la preparación. Lleva acoplado
un tambor graduado en divisiones de 0,001 mm que se utiliza para precisar sus
movimientos y puede medir el espesor de los objetos
Sistema Óptico
El sistema óptico es
el encargado de reproducir y aumentar las imágenes mediante el conjunto de
lentes que lo componen. Está formado por los oculares y los objetivos.
·
Los oculares. Los
oculares están constituidos generalmente por dos lentes, dispuestas sobre un
tubo corto. Los oculares generalmente más utilizados son los de: 8X, 1OX,
12.5X, 15X. La X se
utiliza para expresar en forma abreviada los aumentos.
·
Los objetivos. Los
objetivos producen aumento de las imágenes de los objetos y organismos y, por
tanto, se hallan cerca de la preparación que se examina. Los objetivos
utilizados corrientemente son de dos tipos: objetivos secos y objetivos de
inmersión.
·
Los objetivos
secos
se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre ellos y la
preparación. En la cara externa llevan una serie de índices que indican el
aumento que producen, la abertura numérica y otros datos. Asi
por ejemplo, si un objetivo
tiene estos datos: plan 40/0,65
y 160/0,17, significa que el objetivo es planacromático, su aumento 40 y su
abertura numérica 0,65, calculada para una longitud de tubo de 160 mm. El número de objetivos
varía con el tipo de microscopio y el uso a que se destina. Los aumentos de los
objetivos secos más frecuentemente utilizados son: 6X, 1OX, 20X, 45X y 60X.
·
El objetivo
de inmersión
está compuesto por un complicado sistema de lentes. Para observar a través de
este objetivo es necesario colocar una gota de aceite
de cedro entre el objetivo y la preparación, de manera que la lente frontal
entre en contacto con el aceite de cedro. Generalmente, estos objetivos son de
1 OOX y se distingue por uno o dos círculos o anillos de color negro
que rodea su extremo inferior.
Los objetivos se
disponen en una pieza giratoria denominada revólver.
Sistema de Iluminación
Este sistema tiene
como finalidad dirigir la luz natural o artificial de tal manera que ilumine la
preparación u objeto que se va a observar en el microscopio. Comprende los
siguientes elementos:
·
El espejo. Tiene dos caras: una cóncava y
otra plana. Goza de movimientos en todas las direcciones. La cara cóncava se
emplea de preferencia con iluminación artificial, y la plana, para iluminación
natural (luz solar). Modernamente se prescinde del espejo en la fabricación de
microscopios, ya que éstos traen incorporada una lámpara colocada en el eje del
microscopio.
·
Condensador. El condensador está formado por
un sistema de lentes, cuya finalidad es concentrar los rayos luminosos sobre el
plano de la preparación. El condensador se halla debajo de la platina. El
condensador puede deslizarse sobre un sistema de cremallera mediante un
tornillo que determina su movimiento ascendente o descendente.
·
Diafragma. Generalmente, el condensador está
provisto de un diafragma-iris, que regula su abertura y controla la calidad de
luz que debe pasar a través del condensador.
Partes del microscopio óptico
V.
MANEJO DEL MCROSCOPIO
1.
Colocar el objetivo de menor
aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el
microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en
esas condiciones.
2.
Colocar la preparación sobre la
platina sujetándola con las pinzas metálicas.
3.
Comenzar la observación con el
objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la
preparación es de bacterias.
4.
Para realizar el enfoque:
a.
Acercar al máximo la lente del
objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe
hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el
riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de
ellos o ambos.
b.
Mirando, ahora sí, a través de
los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el
macrométrico y, cuando se observe algo nítido la muestra, girar el micrométrico
hasta obtener un enfoque fino.
5.
Pasar al siguiente objetivo. La
imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco
el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se
perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo
anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a
muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos
de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones
anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación
que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.
6.
Empleo del objetivo de inmersión:
a.
Bajar totalmente la platina.
b.
Subir totalmente el condensador
para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a
visualizar y donde habrá que echar el aceite.
c.
Girar el revólver hacia el
objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de x40.
d.
Colocar una gota mínima de aceite
de inmersión sobre el círculo de luz.
e.
Terminar de girar suavemente el
revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.
f.
Mirando directamente al objetivo,
subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese
momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.
g.
Enfocar cuidadosamente con el
micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la
preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de
accidente es muy grande.
h.
Una vez se haya puesto aceite de
inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x
sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro
campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.
i.
Una vez finalizada la observación
de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento
girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la
platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de
observación.
j.
Limpiar el objetivo de inmersión
con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el
objetivo 40x está perfectamente limpio.
TECNICAS DE
COLORACION, PREPARACION DE MUESTRAS EN FRESCO Y EN SECO
1.
FUNDAMENTO
Técnicas de tinción
El tamaño de la mayoría de las células
bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La
principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la
rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de
colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de
células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares,
tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad
respiratoria, etc.
Las células generalmente son tratadas
para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso llamado fijación. Para
bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque también puede
fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes. Después
de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios
estruturales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células
que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el agente
fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación produce
habitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por el contrario,
hace que las células aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que
las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse
con mucha precisión.
La mayoría de los colorantes son
compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales
celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas
positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes
celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los
polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de
metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas
cargadas negativameute (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares
cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen
la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son
sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los
materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la
localización de las gotículas o depósítos de grasa. Un ejemplo de colorante
liposoluble es el negro Sudán.
Algunos colorantes teñirán mejor sólo
después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no
es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un
mordiente habitual es el ácido tánìco. El mordiente se combina con un
constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el
colorante.
Si se desea simplemente incrementar el
contraste de las células para la microscopía, son suficientes los
procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen colorante
simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no
produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es
especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras
naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe.
La tinción negativa es el reverso del
procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero se colorea
en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las
células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco
que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea
las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de particulas de
carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La
tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las
células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la
presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.
Los métodos de tinción son de gran
utilidad, pero deben usarse siempre con precaución, ya que pueden conducir a
errores. Las moléculas de colorante forman en ocasiones precipitados o
agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son
formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales
estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para
tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto
es una estructura realmente existente.
Tinciòn con hematoxilina -eosina
El
método supone la aplicación de la tinción de hematoxilina, que por ser
catiónica o básica, tiñe estructuras ácidas (basófilas) en tonos Azul y Púrpura,
como por ejemplo los núcleos celulares; y el uso de eosina que tiñe componentes
básicos (acidófilos) en tonos de color rosa, gracias a su
naturaleza aniónica o ácida, como el citoplasma.
Coloraciones con Giensa y
Whrigt
La tinción de
Giensa es un método
habitual para el examen de frotis sanguíneos, cortes histológicos y otro tipo
de muestras biológicas. Este método tiene utilidad sobre todo para poner de
manifiesto las ricketsias localizadas dentro de la célula huéspedes. La
coloración de giemsa se emplea también para teñir frotis de sangre en el examen
para protozoos. Se puede emplear, como variaciones, otras coloraciones como es
la técnica de citoconcentración para parásitos sanguíneos, la cual tiene un
bajo coste y ofrece la posibilidad de aislar e identificar en el mismo
sedimento el parásito principal, con excepción de los trofozoitos jóvenes y el
plasmodium falciparum. También se emplea la modificación de Wright. Este método
de tinción permite también la tinción diferencial de zonas con un alto
contenido de ADN,
y concretamente de uniones A-T. Esto permite distinguir perfectamente en
microscopio óptico el núcleo celular, los cromosomas
durante la mitosis,
y en algunos casos, incluso el ADN mitocondrial (kinetoplasto
de algunos protozoos, como Trypanosoma). Los cromosomas
pueden ser tratados con varios compuestos químicos que producen la alternancia
de bandas claras y oscuras a lo largo de los cromosomas. Cada cromosoma tiene
un patrón de bandas característico, permitiendo que aberraciones estructurales como borrados,
duplicaciones o sutiles translocaciones sean detectadas, al igual que permite
la identificación de cromosomas marcadores.
- Citoplasma: rosa
- Núcleos: azul
- Eritrocitos: rosa - naranja
- Gránulos de las células cebadas: púrpura
- Bacterias: azul
- Parásitos: azul
Tinción
de Giensa de una biopsia de una lesión de leishmaniasis cutánea.
Debido a que ayuda a distinguir fácilmente las células de la sangre se
convirtió en una técnica muy usada para el conteo de los glóbulos blancos, una técnica rutinaria usada
cuando hay sospecha de infecciones.
Melanoma amelanítico maligno en
perro. Tinción de Wright-Leishman. Células grandes del tipo epiteloide
presentes en
agregados, similar a un tumor epitelial.
Coloraciones Gram
Fundamentos
de diferenciación de Gram positivo y Gram negativo
Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes
celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas
La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa
de peptidoglucano,
además de dos clases de ácidos
teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a
la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más
en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el
peptidoglucano (también conocido como mureína)
Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es
delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de
composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa
delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas.
La membrana exterior está hecha de proteína,
fosfolípido
y lipopolisacárido.
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido
a estas direrencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano,
ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y
las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se
debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla
de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada
como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó
previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración
azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared
celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son
susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando
los poros
cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal
violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea
Preparación de un frotis
Sobre un portaobjetos de vidrio,
limpio y seco, se coloca una gota del material que se va a teñir (si es
líquido) o se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra. Una vez que el
hisopo ha tocado la superficie del portaobjetos, que no está estéril, ya no
puede ser empleado para inocular los medios de cultivo. Puede usarse una aguja
estéril para transferir una pequeña cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie
del portaobjetos. Este material es suspendido en una gota de agua o solución
salina previamente colocada sobre el portaobjetos. Cuando se trata de colonias
muy pequeñas que pueden perderse en una gota de líquido se emplea una varilla
delgada de madera estéril con la cual se toca la colonia obteniéndose así una
fracción apreciable del desarrollo. El material se frota directamente sobre el
portaobjetos, donde puede visualizarse con facilidad. El material colocado en
el portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona
azul de la llama de un mechero de Bunsen hasta que el vidrio esté tan caliente
que moleste al tacto pero no queme.
HEMOGRAMA
Sangre: células sanguíneas
Especie: humano (Homo sapiens; mamíferos)
Técnica: Hematoxilina-eosina en
frotis sanguíneo.
¿Qué es un hemograma?
En medicina el hemograma o CSC (conteo
sanguíneo completo) o biometría hemática es uno de los
elementos diagnósticos básicos. Es un cuadro o
fórmula sanguínea en el que se expresan el número, proporción y variaciones de
los elementos sanguíneos.
El hemograma es un análisis de sangre en el que
se mide en global y en porcentajes los tres tipos básicos de células que
contiene la sangre, las denominadas tres series celulares sanguíneas:
- Serie eritrocitaria o serie roja
- Serie leucocitaria o serie blanca
 Serie plaquetaria
Cada una de estas series tiene unas funciones
determinadas, y estas funciones se verán perturbadas si existe alguna
alteración en la cantidad o características de las células que las componen.
La serie roja está
compuesta por los hematíes o glóbulos rojos. Su función primordial es
transportar el oxígeno desde los pulmones (a donde llega a través de la
respiración) a todas las células y tejidos del organismo.
En el hemograma se cuantifica el número de
hematíes, el hematocrito, la hemoglobina y los índices eritrocitarios:
§
El hematocrito
mide el porcentaje de hematíes en el volumen total de la sangre. Es la
proporción entre los hematíes y el plasma sanguíneo
§
Mujeres: 37 -
42%
§
Hombres: 40 -
50%
§
La hemoglobina
es una molécula que forma parte del hematíe, y que es la que transporta el
oxígeno y el dióxido de carbono; se mide su concentración en sangre.
§
Mujeres: 11,5 -
14,5 g/dL
§
Hombres: 13,5 -
16,0 g/Dl
§
Los índices
eritrocitarios proporcionan información sobre el tamaño (VCM), la cantidad (HCM)
y la concentración (CHCM) de hemoglobina de los hematíes; el más usado es el
VCM o volumen corpuscular medio.
Índices
eritrocitarios
§
Volumen
corpuscular medio (VCM), se obtiene dividiendo el hematocrito entre el número
de hematíes.
§
Valores
normales: 78 - 100 fL
§
Hemoglobina
corpuscular media (HCM), se obtiene dividiendo la hemoglobina entre el número
de hematíes
§
Valores
normales: 27 - 32 pG
§
Concentración de
hemoglobina corpuscular media (CHCM), se obtiene dividiendo la hemoglobina
entre el hematocrito
§
Valores
normales: 30 - 35 g/dL
§
Mujeres: 4,2 -
5,4 millones/mm³ (En unidades SI: 4,2 - 5,4 x10¹²/L)
§
Hombres: 4,6 -
6,2 millones/mm³ (En unidades SI: 4,6 - 6,2 x10¹²/L)
Todos estos valores varían dentro de la
normalidad según la edad y el sexo, en este caso hemos considerado los valores para un
adulto.
La serie blanca está
formada por los leucocitos o glóbulos blancos. Sus funciones principales son
la defensa del organismo ante las infecciones y la reacción frente a
sustancias extrañas.
El recuento de leucocitos tiene dos componentes.
Uno es la cifra total de leucocitos en 1 mm3 de sangre venosa; el otro, la
fórmula leucocitaria, mide el porcentaje de cada tipo de leucocitos, que son:
segmentados o neutrófilos, monocitos, linfocitos, eosinófilos y basófilos. El
aumento del porcentaje de un tipo de leucocitos conlleva disminución en el
porcentaje de otros.
La formula leucocitaria consiste en la diferenciación de los distintos
tipos de leucocitos de la sangre. además se puede hacer une studio sacando
sangre de la medula osea y se podra saber si estamos en un caso d e anemia
guda muy conila la que causa la muerte tiempo después Se diferencian los
siguientes tipos celulares básicos: polimorfonucleares (de
los cuales los neutrófilos segmentados constituyen el
45-75%, eosinófilos 0-3% y basófilos( 0-2%),linfocitos (15-45%)
y monocitos (5-10%).
§
Valores
normales: 4,5 - 10,5 mil/mm³ (En unidades SI: 4,5 - 10,5 x109/L).
Estos valores varían dentro de la normalidad
según la edad. hemos considerado de un adulto.
La serie plaquetaria compuesta
por plaquetas o trombocitos, se relaciona con los procesos de coagulación
sanguínea.
En el hemograma se cuantifica el número de
plaquetas y el volumen plaquetario medio (VPM). El VPM proporciona
información sobre el tamaño de las plaquetas.
§
Valores
normales: 150.000 - 400.000 /mm³ (En unidades SI: 150 - 400 x 109/L).
El recuento de plaquetas también varía con la
edad. hemos considerado adulto
|
¿Como se realiza?
Esta prueba no precisa ayuno previo. Previa
desinfección se extraen en torno a 5 cc de sangre venosa, generalmente de una
vena de la flexura del codo. Tras terminar la extracción y retirar la aguja,
se aplica presión en el punto de punción durante unos minutos. Posteriormente
se comprueba que no haya hemorragia en dicho punto.
|
El hemograma es una prueba que sirve para
orientar hacia el diagnóstico de diversas enfermedades que se han sospechado
por la historia clínica y la exploración física.
A veces, los datos que nos da son suficientes
para confirmar o descartar la enfermedad sospechada, pero con frecuencia se
necesita utilizar otras pruebas diagnósticas que aporten más información.
|
¿Cuáles son los factores que interfieren en los
resultados?
Serie roja:
§
Alteración en el
tamaño de los hematíes.
§
Un número muy
alto de leucocitos.
§
Hemodilución:
aumento de la cantidad proporcional de agua en la sangre.
§
Deshidratación:
pérdida de agua del organismo, que se refleja en la sangre.
§
Embarazo: porque
se produce hemodilución.
§
Residencia a
gran altitud: por ejemplo, la gente que vive en el altiplano andino.
§
Hemorragia
inmediatamente previa a la prueba.
§
Medicamentos.
Serie blanca:
§ La ingestión de algunos alimentos, la actividad física y el estrés
pueden aumentar el número de leucocitos.
§ Durante el último mes de embarazo y en el parto, puede aumentar la
cifra de leucocitos.
§ Las personas a las que se les ha extirpado el bazo pueden tener una
elevación leve y persistente de la cifra de leucocitos.
§ Medicamentos, que pueden aumentar o disminuir los niveles.
Serie plaquetaria:
§
La residencia a
gran altitud puede aumentar los niveles de plaquetas.
§
El ejercicio muy
intenso puede aumentar el número de plaquetas.
§ Medicamentos, que pueden aumentar o disminuir las cifras.
|
2.
OBJETIVOS
- Diferenciar
y explicar el fundamento de las distintas coloraciones.
- Realizar coloraciones con
muestras biológicas y observarlas al microscopio
3.
MATERIALES
Microscopio
óptico- Pipetas
Pasteur
- Goteros
- Agua
destilada
- Mechero
- Azul
de metileno
- Giemsa
- Safranina
- Eosina
- Violeta
de genciana
- Wright
- Fucsina
- Verde
de Janus
hemat
4.
PROCEDIMIENTO
CELULAS EUCARIOTAS
MUESTRA: sangre
venosa
COLORACION NEUTRA: Wright
CELULAS: Glóbulos
rojos, glóbulos blancos (basófilos, neutrófilos, eosinófilos, monocitos y
linfocitos)
AUMENTO: 1000X
• Con la ayuda de una lanceta extrajimos una gota de sangre de dedo de un estudiante,
lo colocamos en un porta objeto y ayudados de otro porta objeto deslizamos un
frotis
• Procedimos a hacer lo mismo con 2 muestras
más.
• Luego lo teñimos con Wright,
lo dejamos reposar por un minutos, después lo lavamos con agua destilada,
dejando secar por espacio de 8 minutos.
• Una vez que seco la muestra,
se le coloco aceite de inmersión, observando al microscopio con un aumento de
1000X.
con tinción Wright… 1000X
• Lo mismo se realizo con las demás muestras.
5. RESULTADOS.
Muestra
de sangre venosa:
ü 
En esta muestra podemos observar presencia de glóbulos rojos,
caracterizados porque no presenta núcleo, también porque son en mayor numero a
los demás elementos formes que se encuentran en un hematocrito.
ü 
Pudimos observar la presencia de dos glóbulos blancos caracterizados por
su núcleo grande, entre ellos la presencia de un basófilo.
ü También observamos plaquetas, caracterizadas por ser células muy
pequeñas.
Leucocitos
o Glóbulos Blanco.
En todas las imágenes q a
continuación se muestra, han sido realizadas a un aumento de 400X, y con la
coloración May Grunwald - Giemsa
Neutrófilos
Linfocitos
|
|
 Linfocitos normales.
El núcleo es redondo y no tan comprimido se observa un reborde Aumento:
40ces
Co
|
Eosinófilos
Basófilos
Monocitos
6.
DISCUCIONES.
§ ¿Para qué se utiliza la
coloración con Wright?
El colorante de Wright es utilizado en frotis sanguíneos para distinguir
estructuras de la sangre que en condiciones naturaleza serían imposibles de
distinguir, Co esta técnica se pueden observar la existencia de anomalías
sanguíneas, también para observar los eritrocitos(glóbulos rojos), los glóbulos
blancos y plaquetas
§ ¿Cuál es la composición
química de la coloración Wright?
El colorante de Wright está compuesto de una solución de eosinatos de
azul y azures de metileno en metanol-glicerina y diluido con diluyente de
"shit" y folatos (q entran en el citoplama de los helmintos),
preparadas a base de SOSA (naOH) y a base de colorantes de acentuado poder
policromatofilo.
§ ¿Cuáles son los componentes
de la coloración Gram?
La tinción de gram es una tinción diferencial para distinguir bacterias
gram positivas (violetas) de las gram negativas (rosadas). Para realizarla
debes emplear los siguientes reactivos:
1. Cristal Violeta o Violeta de Genciana
2.Lugol
3.Alcohol 96º
4.Safranina como colorante básico diferenciador
7. CONCLUSIONES.
ü Ayudados por la base teórica, pudimos reconocer y
afianzar las características de las células procariotas y eucariotas en
muestras biológicas, diferenciadas principalmente en la presencia del núcleo.
ü Realizamos la coloración simple para observar
células de la mucosa bucal ayudados por la safranina y el azul de metileno,
pidiendo observar sus partes y también las bacteria que en ella están
presentes.
ü Realizamos la coloración neutra para observar las
células sanguíneas ayudados con Wright y también para poder diferenciarlas,
entre glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas, diferenciándose la forma,
tamaño y cantidad, es decir, que células están en abundancia en una muestra
sanguínea.
ü Observamos también bacterias gram+ caracterizadas
por la presencia de una coloración rosada y las gram- se tiñen de color violeta.
8. BIBLIOGRAFIA
·
Alberts, B et al; (1996) Biología Molecular
de la Célula. 3ra Edición. Ediciones Omega S.A.
Barcelona.
·
De Robertis(h); Hib; Ponzio. (1996).Biología
Celular y Molecular de De Robertis. 12º
Edición. El Ateneo. Bs.As.
·
De Robertis, E.; Hib, J.; (1998) .Fundamentos
de Biología Celular y Molecular. El Ateneo. Bs.As.
·
Karp, G.; (1998) Biología Celular y
Molecular. Ed. Mc Graw Hill Interamericana. México.
·
Solomon y col. (1998). Biología de Villee. 4ª. Ed. Mex. McGraw-Hill. Interamericana
9. LINCOGRAFÍA
