Microscopia

Introducción

En su afán de llegar siempre lejos en la investigación de la naturaleza más allá de lo que los límites de nuestros órganos sensoriales le imponen, el hombre ha construido múltiples instrumentos que le han permitido acceder allí donde los sentidos no podían penetrar.

Así como el telescopio abrió a la humanidad las puertas de lo infinitamente grande, el microscopio hizo posible conocer los mundos de dimensiones ínfimas, entre ellos la célula, base de la vida. Se contaban así las bases de las modernas ciencias biológicas que hasta entrada la edad moderna se habían fundado en las observaciones directas.

Los microscopios son aparatos que, en virtud de las leyes de formación de imágenes ópticas aumentadas a través de lentes convergentes, permiten la observación de pequeños detalles de una muestra dada que a simple vista no se percibirían.

MICROSCOPÍA

I.              Fundamento 

Historia

• 1608 Zacharias Jansen construye un microscopio con dos lentes convergentes.
• 1611 Kepler sugiere la manera de fabricar un microscopio compuesto.
• 1665 Robert Hooke utiliza un microscopio compuesto para estudiar cortes de corcho y describe los pequeños poros en forma de caja a los que él llamó "células". Publica su libro Micrographia.
• 1674 Leeuwenhoek informa su descubrimiento de protozoarios. Observará bacterias por primera vez 9 años después.
• 1828 W. Nicol desarrolla la microscopía con luz polarizada.
• 1838 Schleiden y Schwann proponen la teoría de la célula y declaran que la célula nucleada es la unidad estructural y funcional en plantas y animales.
• 1849 J. Quekett publica un tratado práctico sobre el uso del microscopio.
• 1876 Abbé analiza los efectos de la difracción en la formación de la imagen en el microscopio y muestra cómo perfeccionar el diseño del microscopio.
• 1881 Retzius describe gran número de tejidos animales con un detalle que no ha sido superado por ningún otro microscopista de luz. En las siguientes dos décadas él, Cajal y otros histólogos desarrollan nuevos métodos de tinción y ponen los fundamentos de la anatomía microscópica.
• 1886 Carl Zeiss fabrica una serie de lentes, diseño de Abbé que permiten al microscopista resolver estructuras en los límites teóricos de la luz visible.
• 1908 Köhler y Siedentopf desarrollan el microscopio de fluorescencia.
• 1930 Lebedeff diseña y construye el primer microscopio de interferencia.
• 1932 Zernike inventa el microscopio de contraste de fases.
• 1937 Ernst Ruska y Max Knoll, físicos alemanes, construyen el primer microscopio electrónico.
• 1952 Nomarski inventa y patenta el sistema de contraste de interferencia diferencial para el microscopio de luz.

Microscopio compuesto

Es un microscopio óptico que tiene más de una lente de objetivo. Los microscopios compuestos se utilizan especialmente para examinar objetos transparentes, o cortados en láminas tan finas que se transparentan. Se emplea para aumentar o ampliar las imágenes de objetos y organismos no visibles a simple vista. El microscopio óptico común está conformado por tres sistemas:

• El sistema mecánico está constituido por una palanca que sirve para sostener, elevar y detener los instrumentos a observar.
• El sistema de iluminación comprende un conjunto de instrumentos, dispuestas de tal manera que producen las ranuras de luz.

El sistema óptico comprende las partes del microscopio que permiten un aumento de los objetos que se pretenden observar mediante filtros llamados "de aceites de inmersión".

Trayectoria del rayo de luz a través del microscopio

El haz luminoso procedente de la lámpara pasa directamente a través del diafragma al condensador. Gracias al sistema de lentes que posee el condensador, la luz es concentrada sobre la preparación a observar. El haz de luz penetra en el objetivo y sigue por el tubo hasta llegar al ocular, donde es captado por el ojo del observador.

Propiedades del microscopio

• Poder separador. También llamado a veces poder de resolución, es una cualidad del microscopio, y se define como la distancia mínima entre dos puntos próximos que pueden verse separados. El ojo normal no puede ver separados dos puntos cuando su distancia es menor a una décima de milímetro. En el microscopio viene limitado por la longitud de onda de la radiación empleada; en el microscopio óptico, el poder separador máximo conseguido es de 0,2 décimas de micrómetro (la mitad de la longitud de onda de la luz azul), y en el microscopio electrónico, el poder separador llega hasta 10 Å.
• Poder de definición. Se refiere a la nitidez de las imágenes obtenidas, sobre todo respecto a sus contornos. Esta propiedad depende de la calidad y de la corrección de las aberraciones de las lentes utilizadas.
• Ampliación del microscopio. En términos generales se define como la relación entre el diámetro aparente de la imagen y el diámetro o longitud del objeto. Esto quiere decir que si el microscopio aumenta 100 diámetros un objeto, la imagen que estamos viendo es 100 veces mayor linealmente que el tamaño real del objeto (la superficie de la imagen será 100², es decir 10.000 veces mayor). Para calcular el aumento que está proporcionando un microscopio, basta multiplicar los aumentos respectivos debidos al objetivo y el ocular empleados. Por ejemplo, si estamos utilizando un objetivo de 45X y un ocular de 10X, la ampliación con que estamos viendo la muestra será: 45X x 10X = 450X, lo cual quiere decir que la imagen del objeto está ampliada 450 veces, también expresado como 450 diámetros.

Campo del microscopio

Paramecium aurelia. Microscopio óptico. El mejor conocido de los ciliados. Las burbujas que se ven son vacuolas. Todo el cuerpo está cubierto de cilios, que se ven borrosos debido a sus rápidos movimientos.

Se denomina campo del microscopio al círculo visible que se observa a través del microscopio. También podemos definirlo como la porción del plano visible observado a través del microscopio. Si el aumento es mayor, el campo disminuye, lo cual quiere decir que el campo es inversamente proporcional al aumento del microscopio. Para medir el diámetro del campo del microscopio con cualquiera de los objetivos se utiliza el micrómetro, al que se hará referencia en el siguiente punto

Tipos de microscopios

Existen diversas clases de microscopios, según la naturaleza de los sistemas de luz, y otros accesorios utilizados para obtener las imágenes.

El microscopio compuesto u óptico utiliza lentes para ampliar las imágenes de los objetos observados. El aumento obtenido con estos microscopios es reducido, debido a la longitud de onda de la luz visible que impone limitaciones. El microscopio óptico puede ser monocular, y consta de un solo tubo. La observación en estos casos se hace con un solo ojo. Es binocular cuando posee dos tubos. La observación se hace con los dos ojos. Esto presenta ventajas tales como mejor percepción de la imagen, más cómoda la observación y se perciben con mayor nitidez los detalles.

Microscopio estereoscópico: el microscopio estereoscópico hace posible la visión tridimensional de los objetos. Consta de dos tubos oculares y dos objetivos pares para cada aumento. Este microscopio ofrece ventajas para observaciones que requieren pequeños aumentos. El óptimo de visión estereoscópica se encuentra entre 2 y 40X o aumento total del microscopio.

Microscopio de campo oscuro. Este microscopio está provisto de un condensador paraboloide, que hace que los rayos luminosos no penetren directamente en el objetivo, sino que iluminan oblicuamente la preparación. Los objetos aparecen como puntos luminosos sobre un fondo oscuro.

Microscopio de fluorescencia. La fluorescencia es la propiedad que tienen algunas sustancias de emitir luz propia cuando inciden sobre ellas radiaciones energéticas. El tratamiento del material biológico con flurocromos facilita la observación al microscopio.

Microscopio de contraste de fases. Se basa en las modificaciones de la trayectoria de los rayos de luz, los cuales producen contrastes notables en la preparación.

Invención del microscopio electrónico

En 1932, Bruche y Johnsson construyen el primer microscopio electrónico a base de lentes electrostáticas. Ese mismo año Knoll y Ruska dan a conocer los primeros resultados obtenidos con un microscopio electrónico Siemens, construido con lentes magnéticas. Así nace el microscopio electrónico. Para 1936 ya se ha perfeccionado y se fabrican microscopios electrónicos que superan en resolución al microscopio óptico.

Estos logros no sólo representan un avance en el campo de la electrónica, sino también en el campo de la Biología, pues son muchas las estructuras biológicas que se han descubierto y que revelan detalles inusitados, al observarlas al microscopio electrónico.

Funcionamiento del microscopio electrónico

El microscopio electrónico utiliza un flujo de electrones en lugar de luz. Consta fundamentalmente de un tubo de rayos catódicos, en el cual debe mantenerse el vacio. El cátodo está constituido por un filamento de tungsteno, que al calentarse eléctricamente emite los electrones, los cuales son atraídos hacia el ánodo por una diferencia de potencial de 50.000 a 100.000 voltios. La lente del condensador enfoca este haz y lo dirige hacia el objeto que se observa, cuya preparación exige técnicas especiales. Los electrones chocan contra la preparación, sobre la cual se desvían de manera desigual.

Se acostumbra a utilizar el término microfotografías para las fotografías tomadas a través del microscopio óptico y micrografía o electromicrografía para las que se toman en el microscopio electrónico.

Los aumentos máximos conseguidos en el microscopio electrónico son del orden de 2.000.000X mediante el acoplamiento al microscopio electrónico de un amplificador de imagen y una cámara de televisión. En resumen, el microscopio electrónico consta esencialmente de:

• Un filamento de tungsteno (cátodo) que emite electrones.
• Condensador o lente electromagnética, que concentra el haz de electrones.
• Objetivo o lente electromagnética, que amplía el cono de proyección del haz de luz.
• Ocular o lente electromagnética, que aumenta la imagen.
• Proyector o lente proyectora, que amplía la imagen.
• Pantalla fluorescente, que recoge la imagen para hacerla visible al ojo humano.

Tipos de microscopios electrónicos

Existen varios tipos de microscopios electrónicos, que cada día se perfeccionan más. El microscopio electrónico de transmisión que utiliza un haz de electrones acelerados por un alto voltaje (cien mil voltios). Este haz ilumina una sección muy fina de la muestra, sean tejidos, células u otro material.

El microscopio electrónico de barrido se utiliza para el estudio de la morfología y la topografía de los elementos. Estos instrumentos utilizan voltajes cercanos a los 20.000 voltios. Las lentes magnéticas utilizan un haz muy fino de electrones para penetrar repetidamente la muestra, y se produce una imagen ampliada de la superficie observada en la pantalla de un monitor. El microscopio electrónico mixto tiene propiedades comunes con el de transmisión y con el de barrido y resulta muy útil para ciertas investigaciones. Hay otros microscopios analíticos que detectan señales características de los elementos que constituyen la muestra.

Con estos poderosos instrumentos, que utilizan el flujo de electrones y las radiaciones electromagnéticas así como la aplicación de técnicas histoquímicas y bioquímicas, además del empleo de marcadores radiactivos, se han logrado grandes avances en la biología celular.

Medición a través del microscopio

Muchas veces interesa al observador conocer el tamaño real de los objetos o microorganismos que está observando a través del microscopio. Para estas mediciones pueden utilizarse varios métodos. Método de los micrómetros. Se utiliza para esto un micrómetro de platina o de objetivo, que consiste en un portaobjetos en cuyo centro se halla una escala graduada (de 2 mm. de longitud), con separaciones, entre cada división, de una centésima de milímetro.

Además se utiliza un micrómetro ocular que lleva una escala graduada en décimas de milímetros. Se coloca el micrómetro objetivo sobre la platina y se enfoca el microscopio hasta que las líneas de la escala graduada aparezcan nítidas. Luego se hace superponer la escala del ocular y se toma como referencia las primeras divisiones en que una línea del micrómetro objetivo y una línea del micrómetro ocular coincidan o se superpongan exactamente.

Luego, por simple regla de tres, se calcula el valor en mieras de cada división ocular. Veamos un ejemplo. Si 9 divisiones del micrómetro objetivo (0,09mm) equivalen a 30 divisiones del micrómetro ocular, cada división del ocular equivaldrá a: 0,09/30 = 0,003 mm. = 3 µm

Quiere decir que para el objetivo calibrado y el ocular utilizado, cada división del micrómetro ocular equivale a 3 µm. Una vez obtenido este dato para cada objetivo en la forma que hemos expuesto, teniendo el microscopio ocular podrían hacerse todas las mediciones que se deseen. Para medir, por ejemplo, un Paramecium de una preparación, procedemos así: haremos coincidir los extremos del microorganismo con las divisiones del micrómetro ocular. Si la longitud del organismo es de 75 divisiones del micrómetro ocular, y cada división equivale a 3 µm, la longitud del Paramecium será 75x3= 225 µm. También se pueden efectuar mediciones en el microscopio con cámara clara y utilizando una regla. En realidad, estas medidas no son tan exactas como cuando se utilizan micrómetros por errores que se introducen superponiendo imágenes.

Mantenimiento del microscopio

El microscopio debe estar protegido del polvo, humedad y otros agentes que pudieran dañarlo. Mientras no esté en uso debe guardarse en un estuche o gabinete, o bien cubrirlo con una bolsa plástica o campana de vidrio.

Las partes mecánicas deben limpiarse con un paño suave; en algunos casos, éste se puede humedecer con xilol para disolver ciertas manchas de grasa, aceite de cedro, parafina, etc. Que hayan caído sobre las citadas partes.

La limpieza de las partes ópticas requiere precauciones especiales. Para ello debe emplearse papel de óptico que expiden las casas distribuidoras de material de laboratorio ó fotografía o utilizar un paño de algodón. Para el polvillo se puede utilizar un perilla con pincel de pelo de camello. Nunca deben tocarse las lentes del ocular, objetivo y condensador con los dedos; las huellas digitales perjudican la visibilidad, y cuando se secan resulta trabajoso eliminarlas.

Para una buena limpieza de las lentes puede humedecerse el papel de óptica, envolviendo un palillo con algo de punta con una solución de éter/alcohol (70-30 %) y luego pasarlo por la superficie cuantas veces sea necesario. La limpieza de la óptica ha de realizarse en espiral, desde el centro hacia el exterior. El aceite de cedro que queda sobre la lente frontal del objetivo de inmersión debe quitarse inmediatamente después de finalizada la observación. Para ello se puede pasar el papel de óptica impregnado con una gota de xilol. En caso de estar seco debe ponerse la zona a remojo con la solución señalada. Para guardarlo se acostumbra colocar el objetivo de menor aumento sobre la platina y bajado hasta el tope; el condensador debe estar en su posición más baja, para evitar que tropiece con alguno de los objetivos. Guárdese en lugares secos, para evitar que la humedad favorezca la formación de hongos. Ciertos ácidos y otras sustancias químicas que producen emanaciones fuertes, deben mantenerse alejados del microscopio.

Propiedades del Microscopio

·         Poder separador. También llamado a veces poder de resolución, es una cualidad del microscopio, y se define como la distancia mínima entre dos puntos próximos que pueden verse separados. El ojo normal no puede ver separados dos puntos cuando su distancia es menor a una décima de milímetro.

En el microscopio óptico, el poder separador máximo conseguido es de 0,2 décimas de micra, y en el microscopio electrónico, el poder separador llega hasta 10 ángstrom.

·         Poder de definición. Se refiere a la nitidez de las imágenes obtenidas, sobre todo respecto a sus contornos. Esta propiedad depende de la calidad y de la corrección de las aberraciones de las lentes utilizadas.

Aumento del microscopio. En términos generales se define como la relación entre el diámetro aparente de la imagen y el diámetro o longitud del objeto, esto quiere decir que si el microscopio aumenta 100 diámetros un objeto, la imagen que estamos viendo es 100 veces mayor que el tamaño real del objeto. Para calcular el aumento de un microscopio, basta multiplicar el aumento del ocular por el aumento del objetivo. Por ejemplo, si estamos utilizando un ocular de 10X y un objetivo de 45X, el aumento a que estamos viendo la preparación será: 1OX x 45X = 450X, lo cual quiere decir que la imagen del objeto está ampliada 450 veces.

II.           OBJETIVOS

·        Reconocer las partes del microscopio óptico.

·        Conocer su utilización para la observación de distintas muestras biológicas.

III.          MATERIALES Y METODOS

·        Colorantes

·        Aceite de inmersión

·        Microscopio compuesto

IV.          PROCEDIMIENTO

Se reconocerán las partes de un microscopio óptico.

Sistema mecánico del Microscopio

La parte mecánica del microscopio comprende: el pie, el tubo, el revólver, el asa, la platina, el carro, el tornillo macrométrico y el tornillo micrométrico. Estos elementos sostienen la parte óptica y de iluminación, además permite los desplazamientos necesarios para el enfoque del objeto.

·         El pie. Constituye la base sobre la que se apoya el microscopio y tiene por lo general forma de Y o bien es rectangular

·         El tubo. Tiene forma cilíndrica y está ennegrecido internamente para evitar las molestias que ocasionan los reflejos de la luz. En su extremidad superior se colocan los oculares.

·         El revólver. Es una pieza giratoria provista de orificios en los cuales se enroscan los objetivos. Al girar el revólver, los objetivos pasan por el eje del tubo y se colocan en posición de trabajo, la cual se nota por el ruido de un piñón que lo fija.

·         La columna, llamada también asa o brazo, es una pieza colocada en la parte posterior del aparato. Sostiene el tubo en su porción superior y por el extremo inferior se adapta al pie.

·         La platina. Es una pieza metálica plana en la que se coloca la preparación u objeto que se va a observar. Presenta un orificio en el eje óptico del tubo que permite el paso de los rayos luminosos a la preparación. La platina puede ser fija, en cuyo caso permanece inmóvil; en otros casos puede ser giratoria, es decir, mediante tornillos laterales puede centrarse o producir movimientos circulares.

·         Carro. Es un dispositivo colocado sobre la platina que permite deslizar la preparación con movimiento ortogonal de adelante hacia atrás y de derecha a izquierda.

·         El tornillo macrométrico. Girando este tornillo, asciende o desciende el tubo del microscopio, deslizándose en sentido vertical gracias a una cremallera. Estos movimientos largos permiten el enfoque rápido de la preparación.

·         El tornillo micrométrico. Mediante el movimiento casi imperceptible que produce al deslizar el tubo o la platina, se logra el enfoque exacto y nitido de la preparación. Lleva acoplado un tambor graduado en divisiones de 0,001 mm que se utiliza para precisar sus movimientos y puede medir el espesor de los objetos

Sistema Óptico

El sistema óptico es el encargado de reproducir y aumentar las imágenes mediante el conjunto de lentes que lo componen. Está formado por los oculares y los objetivos.

·         Los oculares. Los oculares están constituidos generalmente por dos lentes, dispuestas sobre un tubo corto. Los oculares generalmente más utilizados son los de: 8X, 1OX, 12.5X, 15X. La X se utiliza para expresar en forma abreviada los aumentos.

·         Los objetivos. Los objetivos producen aumento de las imágenes de los objetos y organismos y, por tanto, se hallan cerca de la preparación que se examina. Los objetivos utilizados corrientemente son de dos tipos: objetivos secos y objetivos de inmersión.

·         Los objetivos secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre ellos y la preparación. En la cara externa llevan una serie de índices que indican el aumento que producen, la abertura numérica y otros datos. Asi por ejemplo, si un objetivo tiene estos datos: plan 40/0,65 y 160/0,17, significa que el objetivo es planacromático, su aumento 40 y su abertura numérica 0,65, calculada para una longitud de tubo de 160 mm. El número de objetivos varía con el tipo de microscopio y el uso a que se destina. Los aumentos de los objetivos secos más frecuentemente utilizados son: 6X, 1OX, 20X, 45X y 60X.

·         El objetivo de inmersión está compuesto por un complicado sistema de lentes. Para observar a través de este objetivo es necesario colocar una gota de aceite de cedro entre el objetivo y la preparación, de manera que la lente frontal entre en contacto con el aceite de cedro. Generalmente, estos objetivos son de 1 OOX y se distingue por uno o dos círculos o anillos de color negro que rodea su extremo inferior.

Los objetivos se disponen en una pieza giratoria denominada revólver.

Sistema de Iluminación

Este sistema tiene como finalidad dirigir la luz natural o artificial de tal manera que ilumine la preparación u objeto que se va a observar en el microscopio. Comprende los siguientes elementos:

·         El espejo. Tiene dos caras: una cóncava y otra plana. Goza de movimientos en todas las direcciones. La cara cóncava se emplea de preferencia con iluminación artificial, y la plana, para iluminación natural (luz solar). Modernamente se prescinde del espejo en la fabricación de microscopios, ya que éstos traen incorporada una lámpara colocada en el eje del microscopio.

·         Condensador. El condensador está formado por un sistema de lentes, cuya finalidad es concentrar los rayos luminosos sobre el plano de la preparación. El condensador se halla debajo de la platina. El condensador puede deslizarse sobre un sistema de cremallera mediante un tornillo que determina su movimiento ascendente o descendente.

·         Diafragma. Generalmente, el condensador está provisto de un diafragma-iris, que regula su abertura y controla la calidad de luz que debe pasar a través del condensador.

Partes del microscopio óptico

V.           MANEJO DEL MCROSCOPIO

1.    Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones.

2.    Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.

3.    Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.

4.    Para realizar el enfoque:

a.    Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.

b.    Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítido la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.

5.    Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.

6.    Empleo del objetivo de inmersión:

a.    Bajar totalmente la platina.

b.    Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.

c.    Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de x40.

d.    Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.

e.    Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.

f.     Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.

g.    Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.

h.    Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.

i.      Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación.

j.      Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.

TECNICAS DE COLORACION, PREPARACION DE MUESTRAS EN FRESCO Y EN SECO

1.            FUNDAMENTO

Técnicas de tinción

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios estruturales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión.

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativameute (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósítos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán.

Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el ácido tánìco. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante.

Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía, son suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe.

La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.

Los métodos de tinción son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaución, ya que pueden conducir a errores. Las moléculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.

Tinciòn con hematoxilina -eosina

La tinción hematoxilina-eosina corresponde a la mezcla de hematoxilina y eosina. La tinción hematoxilina y eosina es uno de los métodos mas populares de tinción utilizado en histología y medicina diagnostica.

El método supone la aplicación de la tinción de hematoxilina, que por ser catiónica o básica, tiñe estructuras ácidas (basófilas) en tonos Azul y Púrpura, como por ejemplo los núcleos celulares; y el uso de eosina que tiñe componentes básicos (acidófilos) en tonos de color rosa, gracias a su naturaleza aniónica o ácida, como el citoplasma.

Núcleo celular: Azul

Citoplasma: Rosa

Musculatura: Rojo , rosa o fucsia

Glóbulos rojos: Rojo, anaranjado

Fibrina: Rosa

Coloraciones con Giensa y Whrigt

La tinción de Giensa es un método habitual para el examen de frotis sanguíneos, cortes histológicos y otro tipo de muestras biológicas. Este método tiene utilidad sobre todo para poner de manifiesto las ricketsias localizadas dentro de la célula huéspedes. La coloración de giemsa se emplea también para teñir frotis de sangre en el examen para protozoos. Se puede emplear, como variaciones, otras coloraciones como es la técnica de citoconcentración para parásitos sanguíneos, la cual tiene un bajo coste y ofrece la posibilidad de aislar e identificar en el mismo sedimento el parásito principal, con excepción de los trofozoitos jóvenes y el plasmodium falciparum. También se emplea la modificación de Wright. Este método de tinción permite también la tinción diferencial de zonas con un alto contenido de ADN, y concretamente de uniones A-T. Esto permite distinguir perfectamente en microscopio óptico el núcleo celular, los cromosomas durante la mitosis, y en algunos casos, incluso el ADN mitocondrial (kinetoplasto de algunos protozoos, como Trypanosoma). Los cromosomas pueden ser tratados con varios compuestos químicos que producen la alternancia de bandas claras y oscuras a lo largo de los cromosomas. Cada cromosoma tiene un patrón de bandas característico, permitiendo que aberraciones estructurales como borrados, duplicaciones o sutiles translocaciones sean detectadas, al igual que permite la identificación de cromosomas marcadores.

• Citoplasma: rosa
• Núcleos: azul
• Eritrocitos: rosa - naranja
• Gránulos de las células cebadas: púrpura
• Bacterias: azul
• Parásitos: azul

                Tinción de Giensa de una biopsia de una lesión de leishmaniasis cutánea.

La tinción de Wright es un tipo de tinción usada en histología para facilitar la diferenciación de los tipos de células de la sangre. Se usa principalmente para teñir frotis de sangre y punciones medulares, para ser examinadas al microscopio. En citogenética se usa para teñir cromosomas, para facilitar el diagnóstico de síndromes y enfermedades.

Lleva el nombre de James Homer Wright, su descubridor, que la obtuvo modificando la tinción de Romanowsky, en 1902.

Debido a que ayuda a distinguir fácilmente las células de la sangre se convirtió en una técnica muy usada para el conteo de los glóbulos blancos, una técnica rutinaria usada cuando hay sospecha de infecciones.

Melanoma amelanítico maligno en perro. Tinción de Wright-Leishman. Células grandes del tipo epiteloide presentes                             en agregados, similar a un tumor epitelial.

Coloraciones Gram

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.

Fundamentos de diferenciación de Gram positivo y Gram negativo

Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas

La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano, además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglucano (también conocido como mureína)

Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido.

Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas direrencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea

Preparación de un frotis

Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va a teñir (si es líquido) o se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra. Una vez que el hisopo ha tocado la superficie del portaobjetos, que no está estéril, ya no puede ser empleado para inocular los medios de cultivo. Puede usarse una aguja estéril para transferir una pequeña cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del portaobjetos. Este material es suspendido en una gota de agua o solución salina previamente colocada sobre el portaobjetos. Cuando se trata de colonias muy pequeñas que pueden perderse en una gota de líquido se emplea una varilla delgada de madera estéril con la cual se toca la colonia obteniéndose así una fracción apreciable del desarrollo. El material se frota directamente sobre el portaobjetos, donde puede visualizarse con facilidad. El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de un mechero de Bunsen hasta que el vidrio esté tan caliente que moleste al tacto pero no queme.

HEMOGRAMA

Sangre: células sanguíneas 
Especie: humano (Homo sapiens; mamíferos)
Técnica: Hematoxilina-eosina en frotis sanguíneo.

¿Qué es un hemograma?

En medicina el hemograma o CSC (conteo sanguíneo completo) o biometría hemática es uno de los elementos diagnósticos básicos. Es un cuadro o fórmula sanguínea en el que se expresan el número, proporción y variaciones de los elementos sanguíneos.

El hemograma es un análisis de sangre en el que se mide en global y en porcentajes los tres tipos básicos de células que contiene la sangre, las denominadas tres series celulares sanguíneas: Serie eritrocitaria o serie roja Serie leucocitaria o serie blanca Serie plaquetaria Cada una de estas series tiene unas funciones determinadas, y estas funciones se verán perturbadas si existe alguna alteración en la cantidad o características de las células que las componen. La serie roja está compuesta por los hematíes o glóbulos rojos. Su función primordial es transportar el oxígeno desde los pulmones (a donde llega a través de la respiración) a todas las células y tejidos del organismo. En el hemograma se cuantifica el número de hematíes, el hematocrito, la hemoglobina y los índices eritrocitarios:   §   El hematocrito mide el porcentaje de hematíes en el volumen total de la sangre. Es la proporción entre los hematíes y el plasma sanguíneo §  Mujeres: 37 - 42% §  Hombres: 40 - 50% §   La hemoglobina es una molécula que forma parte del hematíe, y que es la que transporta el oxígeno y el dióxido de carbono; se mide su concentración en sangre. §  Mujeres: 11,5 - 14,5 g/dL §  Hombres: 13,5 - 16,0 g/Dl §   Los índices eritrocitarios proporcionan información sobre el tamaño (VCM), la cantidad (HCM) y la concentración (CHCM) de hemoglobina de los hematíes; el más usado es el VCM o volumen corpuscular medio. Índices eritrocitarios  §  Volumen corpuscular medio (VCM), se obtiene dividiendo el hematocrito entre el número de hematíes. §  Valores normales: 78 - 100 fL §  Hemoglobina corpuscular media (HCM), se obtiene dividiendo la hemoglobina entre el número de hematíes §  Valores normales: 27 - 32 pG §  Concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM), se obtiene dividiendo la hemoglobina entre el hematocrito §  Valores normales: 30 - 35 g/dL §  Mujeres: 4,2 - 5,4 millones/mm³ (En unidades SI: 4,2 - 5,4 x10¹²/L) §  Hombres: 4,6 - 6,2 millones/mm³ (En unidades SI: 4,6 - 6,2 x10¹²/L) Todos estos valores varían dentro de la normalidad según la edad y el sexo, en este caso    hemos considerado los valores para un adulto. La serie blanca está formada por los leucocitos o glóbulos blancos. Sus funciones principales son la defensa del organismo ante las infecciones y la reacción frente a sustancias extrañas. El recuento de leucocitos tiene dos componentes. Uno es la cifra total de leucocitos en 1 mm3 de sangre venosa; el otro, la fórmula leucocitaria, mide el porcentaje de cada tipo de leucocitos, que son: segmentados o neutrófilos, monocitos, linfocitos, eosinófilos y basófilos. El aumento del porcentaje de un tipo de leucocitos conlleva disminución en el porcentaje de otros. La formula leucocitaria consiste en la diferenciación de los distintos tipos de leucocitos de la sangre. además se puede hacer une studio sacando sangre de la medula osea y se podra saber si estamos en un caso d e anemia guda muy conila la que causa la muerte tiempo después Se diferencian los siguientes tipos celulares básicos: polimorfonucleares (de los cuales los neutrófilos segmentados constituyen el 45-75%, eosinófilos 0-3% y basófilos( 0-2%),linfocitos (15-45%) y monocitos (5-10%). §  Valores normales: 4,5 - 10,5 mil/mm³ (En unidades SI: 4,5 - 10,5 x109/L). Estos valores varían dentro de la normalidad según la edad. hemos considerado de un adulto. La serie plaquetaria compuesta por plaquetas o trombocitos, se relaciona con los procesos de coagulación sanguínea. En el hemograma se cuantifica el número de plaquetas y el volumen plaquetario medio (VPM). El VPM proporciona información sobre el tamaño de las plaquetas. §  Valores normales: 150.000 - 400.000 /mm³ (En unidades SI: 150 - 400 x 109/L). El recuento de plaquetas también varía con la edad. hemos considerado adulto

¿Como se realiza?

Esta prueba no precisa ayuno previo. Previa desinfección se extraen en torno a 5 cc de sangre venosa, generalmente de una vena de la flexura del codo. Tras terminar la extracción y retirar la aguja, se aplica presión en el punto de punción durante unos minutos. Posteriormente se comprueba que no haya hemorragia en dicho punto.

¿Para qué sirve?

El hemograma es una prueba que sirve para orientar hacia el diagnóstico de diversas enfermedades que se han sospechado por la historia clínica y la exploración física. A veces, los datos que nos da son suficientes para confirmar o descartar la enfermedad sospechada, pero con frecuencia se necesita utilizar otras pruebas diagnósticas que aporten más información.

¿Cuáles son los factores que interfieren en los resultados?

Serie roja:   §  Alteración en el tamaño de los hematíes. §  Un número muy alto de leucocitos. §  Hemodilución: aumento de la cantidad proporcional de agua en la sangre. §  Deshidratación: pérdida de agua del organismo, que se refleja en la sangre. §  Embarazo: porque se produce hemodilución. §  Residencia a gran altitud: por ejemplo, la gente que vive en el altiplano andino. §  Hemorragia inmediatamente previa a la prueba. §  Medicamentos. Serie blanca: §  La ingestión de algunos alimentos, la actividad física y el estrés pueden aumentar el número de leucocitos. §  Durante el último mes de embarazo y en el parto, puede aumentar la cifra de leucocitos. §  Las personas a las que se les ha extirpado el bazo pueden tener una elevación leve y persistente de la cifra de leucocitos. §  Medicamentos, que pueden aumentar o disminuir los niveles. Serie plaquetaria: §  La residencia a gran altitud puede aumentar los niveles de plaquetas. §  El ejercicio muy intenso puede aumentar el número de plaquetas. §  Medicamentos, que pueden aumentar o disminuir las cifras.

2.           OBJETIVOS

• Diferenciar y explicar el fundamento de las distintas coloraciones.
• Realizar coloraciones con muestras biológicas y observarlas al microscopio

3.           MATERIALES

• Microscopio óptico
• Pipetas Pasteur
• Goteros
• Agua destilada
• Mechero
• Azul de metileno
• Giemsa
• Safranina
• Eosina
• Violeta de genciana
• Wright
• Fucsina
• Verde de Janus
• hemat

4.           PROCEDIMIENTO

   CELULAS EUCARIOTAS

MUESTRA: sangre venosa

COLORACION NEUTRA: Wright

CELULAS: Glóbulos rojos, glóbulos blancos (basófilos, neutrófilos, eosinófilos, monocitos y linfocitos)

AUMENTO: 1000X

•     Con la ayuda de una lanceta extrajimos  una gota de sangre de dedo de un estudiante, lo colocamos en un porta objeto y ayudados de otro porta objeto deslizamos un frotis

•     Procedimos a hacer lo mismo con 2 muestras más.

•     Luego lo teñimos con Wright, lo dejamos reposar por un minutos, después lo lavamos con agua destilada, dejando secar por espacio de 8 minutos.

•     Una vez que seco la muestra, se le coloco aceite de inmersión, observando al microscopio con un aumento de 1000X.

con tinción Wright… 1000X

•     Lo mismo se realizo con las demás muestras.

5. RESULTADOS. 

Muestra de sangre venosa:

ü  En esta muestra podemos observar presencia de glóbulos rojos, caracterizados porque no presenta núcleo, también porque son en mayor numero a los demás elementos formes que se encuentran en un hematocrito.

ü  Pudimos observar la presencia de dos glóbulos blancos caracterizados por su núcleo grande, entre ellos la presencia de un basófilo.

ü  También observamos plaquetas, caracterizadas por ser células muy pequeñas.

Leucocitos o Glóbulos Blanco.

 En todas las imágenes q a continuación se muestra, han sido realizadas a un aumento de 400X, y con la coloración May Grunwald - Giemsa

Neutrófilos

Linfocitos

Linfocitos normales. El núcleo es redondo y no tan comprimido se observa un reborde Aumento: 40ces Co

Eosinófilos

Basófilos

Monocitos

6. DISCUCIONES.

§  ¿Para qué se utiliza la coloración con Wright?

El colorante de Wright es utilizado en frotis sanguíneos para distinguir estructuras de la sangre que en condiciones naturaleza serían imposibles de distinguir, Co esta técnica se pueden observar la existencia de anomalías sanguíneas, también para observar los eritrocitos(glóbulos rojos), los glóbulos blancos y plaquetas

§  ¿Cuál es la composición química de la coloración Wright?

El colorante de Wright está compuesto de una solución de eosinatos de azul y azures de metileno en metanol-glicerina y diluido con diluyente de "shit" y folatos (q entran en el citoplama de los helmintos), preparadas a base de SOSA (naOH) y a base de colorantes de acentuado poder policromatofilo.

§  ¿Cuáles son los componentes de la coloración Gram?

La tinción de gram es una tinción diferencial para distinguir bacterias gram positivas (violetas) de las gram negativas (rosadas). Para realizarla debes emplear los siguientes reactivos:

1. Cristal Violeta o Violeta de Genciana
2.Lugol
3.Alcohol 96º
4.Safranina como colorante básico diferenciador

7.    CONCLUSIONES.

ü  Ayudados por la base teórica, pudimos reconocer y afianzar las características de las células procariotas y eucariotas en muestras biológicas, diferenciadas principalmente en la presencia del núcleo.

ü  Realizamos la coloración simple para observar células de la mucosa bucal ayudados por la safranina y el azul de metileno, pidiendo observar sus partes y también las bacteria que en ella están presentes.

ü  Realizamos la coloración neutra para observar las células sanguíneas ayudados con Wright y también para poder diferenciarlas, entre glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas, diferenciándose la forma, tamaño y cantidad, es decir, que células están en abundancia en una muestra sanguínea.

ü  Observamos también bacterias gram+ caracterizadas por la presencia de una coloración rosada y las gram- se tiñen de color violeta.

8.     BIBLIOGRAFIA

·         Alberts, B et al; (1996) Biología Molecular de la Célula. 3^ra Edición.                 Ediciones Omega S.A. Barcelona.

·         De Robertis(h); Hib; Ponzio. (1996).Biología Celular y Molecular de De   Robertis. 12º Edición. El Ateneo. Bs.As.

·         De Robertis, E.; Hib, J.; (1998) .Fundamentos de Biología Celular y  Molecular. El Ateneo. Bs.As.

·         Karp, G.; (1998) Biología Celular y Molecular. Ed. Mc Graw Hill Interamericana. México.

·         Solomon y col. (1998). Biología de Villee. 4ª. Ed. Mex. McGraw-Hill. Interamericana

9.    LINCOGRAFÍA

• http://www.jornallivre.com.br/156436/o-que-e-hemograma-completo.html
• http://www.wiphala.net/courses/research/ST235/2007- I/groups/proposal06.pdf
• http://escuela.med.puc.cl/publ/patologiageneral/ManualPatologiaIndice.html